QIIME 2用户文档. 12训练特征分类器Training feature classifiers(2018.11)-

前情提要

QIIME 2可重复、交互和扩展的微生物组数据分析流程
1简介和安装Install
2插件工作流程概述Workflows
3老司机上路指南Experienced
4人体各部位微生物组分析Moving Pictures
5粪菌移植分析练习FMT
6沙漠土壤分析Atacama soil
7差异丰度分析gneiss
8数据导入Importing
9数据导出Exporting
10元数据Metadata
11数据筛选Filtering

训练特征分类器

Training feature classifiers with q2-feature-classifier

https://docs.qiime2.org/2018.11/tutorials/feature-classifier/

注：最好按本教程顺序学习，想直接学习本章，至少完成本系列1简介和安装。
详者注：为什么要训练分类集？因为不同实验的扩增区域不同，鉴定物种分类的精度不同，提前的训练可以让分类结果更准确。

本教程将演示如何为特定数据集训练q2-feature-classifier。我们将使用Greengenes参考数据库序列来训练Naive Bayes分类器，并从《4人体各部位微生物组分析》中获得的代表性序列进行分类。

请注意，QIIME 2数据资源中提供了几个经过预先训练的分类器。这些基因可用于一些常见的标记基因（如16S rRNA基因）注释。其他标记基因的预训练分类器也可以在QIIME2论坛上找到。详见 https://docs.qiime2.org/2018.11/data-resources/，**里面有Silva和Greengenes的全长和V4区的分类器供下载直接使用**。

下载并导入参考序列

Obtaining and importing reference data sets

这里我们使用85_otus.fasta(按85似度聚类)的文件用于演示，是因为体积小运行更快。实际中大家一般使用参考序列9997类的结果用于分类。如果你的电脑或服务器配置太低无法运行，可选择更低聚类的结果文件用于分析。

# 创建工作目录
mkdir training-feature-classifiers
cd training-feature-classifiers

# 下载参考OTU数据集
wget \
-O "85_otus.fasta" \
"https://data.qiime2.org/2018.11/tutorials/training-feature-classifiers/85_otus.fasta"

# 下载参考数据集的物种分类信息
wget \
-O "85_otu_taxonomy.txt" \
"https://data.qiime2.org/2018.11/tutorials/training-feature-classifiers/85_otu_taxonomy.txt"

# 下载代表性序列文件
wget \
-O "rep-seqs.qza" \
"https://data.qiime2.org/2018.11/tutorials/training-feature-classifiers/rep-seqs.qza"

接下来，我们将这些数据导入到qiime 2对象中。由于Greengenes序列物种注释文件（85_otu_Taxonomy.txt）是一个不带标题的制表符分隔文件（tsv），因此必须指定HeaderlessTSVTaxonomyFormat作为源格式，因为默认源格式需要标题。

# 导入参考序列
qiime tools import \
--type 'FeatureData[Sequence]' \
--input-path 85_otus.fasta \
--output-path 85_otus.qza

# 导入物种分类信息
qiime tools import \
--type 'FeatureData[Taxonomy]' \
--input-format HeaderlessTSVTaxonomyFormat \
--input-path 85_otu_taxonomy.txt \
--output-path ref-taxonomy.qza

提取参考序列

Extract reference reads

Werner等人，2012年研究表明，当一个朴素贝叶丝(Naive Bayes)分类器只训练被测序的目标序列的区域时，16S rRNA基因序列的分类准确度会提高。这种策略不一定对其他标记基因同样有效（见下文真菌分类注释）。我们从《4人体各部位微生物组分析》教程中知道，我们试图对序列进行分类的是120个碱基的单端序列，这些读取是用515F/806R引物对16S rRNA基因序列进行扩增的产物。我们在这里通过从参考数据库中提取基于与该对引物匹配的区域，然后将结果截取至120个碱基来对此进行优化。

# 按我们测序的引物来提取参考序列中的一段
qiime feature-classifier extract-reads \
--i-sequences 85_otus.qza \
--p-f-primer GTGCCAGCMGCCGCGGTAA \
--p-r-primer GGACTACHVGGGTWTCTAAT \
--p-trunc-len 100 \
--o-reads ref-seqs.qza

输出结果：

ref-seqs.qza: 提取的扩增区域

注释：-p-trunc-len参数只能用于比对序列被剪裁成相同长度或更短的长度时，才需要剪裁参考序列。成功双端合并序列的长度通常是可变的。未在特定长度截断的单端读取的长度也可能是可变的。对于双端和未经修剪的单端读的物种分类，我们建议对在适当的引物位置提取但不修剪为等长的序列进行分类器训练。
注释：用于提取扩增区域的引物序列应该是包含在引物结构中的实际DNA结合（即生物）序列。它不应包含任何非生物、非匹配的序列，例如接头、连接序列或条形码序列。如果你不确定你的引物序列的哪个部分是真正的DNA结合区域，你应该咨询为你构建测序文库的工程师，你选择的测序中心，或者这些引物的原始文献。如果你的引物序列长度大于30nt，它们很可能包含一些非生物序列。
注释：上面的示例命令使用“min-length”和“max-length”参数，来排除使用这些引物远远超出预期长度分布的模拟扩增结果。这样的扩增产物可能是非特异性扩增，应该排除。如果您将此命令调整为自己的项目中使用，请确保选择适合标记基因，而不是此处使用序列或参数。“min-length”参数在“trim-left”和“trunc-len”参数之后应用，在“max-length”之前应用，因此一定要设置适当的设置，以防止有效序列被过滤掉。

训练分类集

Train the classifier

我们将使用下面的命令训练Naive Bayes分类器

# 基于筛选的指定区段，生成实验特异的分类集
qiime feature-classifier fit-classifier-naive-bayes \
--i-reference-reads ref-seqs.qza \
--i-reference-taxonomy ref-taxonomy.qza \
--o-classifier classifier.qza

生成分类器文件：classifier.qza

测试分类集

Test the classifier

下面我们使用训练好的分析器，对《4人体各部位微生物组分析Moving Pictures》中的代表序列进行物种注释。

# 使用训练后的分类集对结果进行注释
qiime feature-classifier classify-sklearn \
--i-classifier classifier.qza \
--i-reads rep-seqs.qza \
--o-classification taxonomy.qza

# 可视化注释的结果
qiime metadata tabulate \
--m-input-file taxonomy.qza \
--o-visualization taxonomy.qzv

结果数据文件：taxonomy.qza
结果可视化网页：taxonomy.qzv

感兴趣的朋友，可以拿这个训练后的结果，和之前的比较。看看有什么变化？

分类真菌ITS序列

Classification of fungal ITS sequences

根据我们的经验，在Unite参考数据库上训练的Fungal ITS分类器不会从提取/修剪引物扩增区域的方法中改善结果。我们建议在完整参考序列上训练Unite分类器。此外，我们推荐使用“developer”版本序列（位于qiime兼容版本下载中），因为标准版序列的本已经被修剪到指定区域（不包括可能存在于标准引物产生的扩增子中的侧翼rRNA基因的部分）。

Reference

Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, Bokulich NA, Abnet C, Al-Ghalith GA, Alexander H, Alm EJ, Arumugam M, Asnicar F, Bai Y, Bisanz JE, Bittinger K, Brejnrod A, Brislawn CJ, Brown CT, Callahan BJ, Caraballo-Rodríguez AM, Chase J, Cope E, Da Silva R, Dorrestein PC, Douglas GM, Durall DM, Duvallet C, Edwardson CF, Ernst M, Estaki M, Fouquier J, Gauglitz JM, Gibson DL, Gonzalez A, Gorlick K, Guo J, Hillmann B, Holmes S, Holste H, Huttenhower C, Huttley G, Janssen S, Jarmusch AK, Jiang L, Kaehler B, Kang KB, Keefe CR, Keim P, Kelley ST, Knights D, Koester I, Kosciolek T, Kreps J, Langille MG, Lee J, Ley R, Liu Y, Loftfield E, Lozupone C, Maher M, Marotz C, Martin BD, McDonald D, McIver LJ, Melnik AV, Metcalf JL, Morgan SC, Morton J, Naimey AT, Navas-Molina JA, Nothias LF, Orchanian SB, Pearson T, Peoples SL, Petras D, Preuss ML, Pruesse E, Rasmussen LB, Rivers A, Robeson, II MS, Rosenthal P, Segata N, Shaffer M, Shiffer A, Sinha R, Song SJ, Spear JR, Swafford AD, Thompson LR, Torres PJ, Trinh P, Tripathi A, Turnbaugh PJ, Ul-Hasan S, van der Hooft JJ, Vargas F, Vázquez-Baeza Y, Vogtmann E, von Hippel M, Walters W, Wan Y, Wang M, Warren J, Weber KC, Williamson CH, Willis AD, Xu ZZ, Zaneveld JR, Zhang Y, Zhu Q, Knight R, Caporaso JG. 2018. QIIME 2: Reproducible, interactive, scalable, and extensible microbiome data science. PeerJ Preprints 6:e27295v2 https://doi.org/10.7287/peerj.preprints.27295v2

译者简介

刘永鑫，博士。2008年毕业于东北农大微生物学专业。2014年中科院遗传发育所获生物信息学博士学位，2016年博士后出站留所工作，任宏基因组学实验室工程师，目前主要研究方向为宏基因组学、数据分析与可重复计算和植物微生物组、QIIME 2项目参与人。发于论文12篇，SCI收录9篇。2017年7月创办“宏基因组”公众号，目前分享宏基因组、扩增子原创文章400+篇，代表博文有《扩增子图表解读、分析流程和统计绘图三部曲》，关注人数3.2万+，累计阅读500万+。

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学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”

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